Свечение высших грибов.

1. Изучение светящихся высших грибов.

Способность некоторых грибов излучать, на разных стадиях их роста, видимый в темноте свет известна человечеству с древних времен. К настоящему времени в разных регионах Земного шара обнаружено более 80 видов светящихся грибов – в Северной и Южной Америке, Европе, Азии (включая Сибирь), Австралии, Африке.

При выполнении проекта нами обнаружено, что слабым свечением – хемилюминесценцией обладает множество видов «несветящихся» высших грибов. Анализ этих данных и данных, известных из литературы, позволили высказать предположение, что грибная хемилюминесценция стала той метаболической основой, из которой в ходе эволюции возникла видимая биолюминесценция грибов.

Основными объектами исследований в ходе выполнения проекта являлся мицелий трех видов светящихся высших грибов (Рис. 1): Neonothopanus nambi (ИБСО 2307) - выделен в тропических лесах Южного Вьетнама вьетнамской исследовательницей Дао Тхи Ван (Dao Thi Van); Armillaria borealis - Marxm. & Korhonen (ИБСО 2310) - выделен Н.В. Пашеновой (ИЛ СО РАН) в окрестностях г. Красноярска (Россия); Panellus stipticus (ИБСО 2301) - выделен Г.А. Выдряковой в пригороде г. Оттава (Канада).

Рис. 1. Внешний вид (слева) и свечение (справа) колоний мицелия трех видов высших грибов при их культивировании в искусственных условиях.

За время выполнения проекта обнаружены еще два светящихся гриба. В ходе научной командировки А.П. Пузырь, К.В. Пуртов и А.Е. Буров обнаружили на острове Борнео (Малайзия) светящийся гриб, который растет на пнях кокосовых пальм. С.Е. Медведева обнаружила в окрестностях г. Красноярска светящийся гриб, принадлежащий к роду Armillaria (опята). Идентификация видов обнаруженных грибов проводится совместно с БИН РАН (г. Санкт-Петербург, Россия).

2. Разработаны условия глубинного культивирования светящихся высших грибов

Разработка условий культивирования светящихся грибов в лабораторных условиях для получения биомассы мицелия, обладающего устойчивым свечением, открывает возможности для проведения широкого спектра исследований: морфологических особенностей светящихся грибов; организации люминесцентных систем и механизмов свечения грибов; возможностей применения грибного свечения в аналитических целях.

Исследования с образцами мицелия при культивировании грибов в чашках Петри на твердых и жидких питательных средах (Рис. 2) имеют некоторые недостатки:

1. Выращивание мицелия проводят в течение длительного (8 – 10 дней) времени.
2. При отборе образцов мицелия для экспериментов гриб повреждается.
3. В ответ на повреждение, у образцов мицелия, помещенных в кювету люминометра, наблюдается медленная кинетика подъема свечения до максимума (от 40 мин до 5 часов) с последующей медленной (несколько часов) кинетикой снижения сигнала до стационарного уровня.

Глубинный способ выращивания мицелия светящихся грибов позволяет:

1. Получать мицелий в виде отдельных глобул шарообразной формы уже через 3 дня выращивания.
2. Глобулы можно легко переносить из одной жидкой среды в другую и помещать в измерительную кювету люминометра. При этом гриб подвергается минимальному механическому воздействию и повреждению.
3. Глобулы, внесенные в измерительную кювету, дают однотипный люминесцентный сигнал (Рис. 2). Регистрируемые сигналы различаются только начальным уровнем свечения, зависящим от размера глобулы, и имеют быструю (3 - 5 мин) кинетику затухания с выходом на стационарный уровень.

Рис. 2. Вверху: внешний вид и свечение мицелия, полученного при его выращивании на твердой среде (1) и при глубинном способе культивирования (2). Внизу: глобулы мицелия в измерительной кювете (слева), люминесцентные сигналы от отдельных глобул (справа).

3. Предложена гипотеза о механизме свечения высших грибов

Относительно механизмов свечения высших грибов существует два альтернативных мнения: 1) биолюминесценция связана с функционированием классической фермент-субстратной системы люцифераза – люциферин, аналогичной существующей у бактерий и животных; 2) свечение связано с хемилюминесцентной реакцией без участия специализированного фермента.

Наши исследования особенностей свечения гриба Neonothopanus nambi позволили выявить два фактора, стимулирующих его биолюминесценцию - перекись водорода и низкомолекулярный компонент, обнаруженный в экстрактах из мицелия. Предполагается, что обнаруженный компонент (названный намбин), является эмиттером (излучателем) реакции свечения. Одновременная добавка намбина и Н₂О₂ вызывает сильное свечение глобул мицелия, которое может продолжаться несколько часов. При повторной добавке Н₂О₂, мицелий вновь реагирует ярким свечением. Аналогия с общеизвестной хемилюминесцентной реакцией люминол - Н₂О₂ позволила высказать гипотезу о возможном механизме свечения гриба (Рис. 3). Исходя из механизма, роль катализатора грибного свечения могут выполнять ионы переходных металлов, ферменты с оксидазной функцией (например, пероксидазы), или эргостерин (провитамин D₂). В дальнейшем планируется выделение намбина в чистом виде и изучение его структуры и свойств.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что система излучения N. nambi находится на клеточной стенке гриба или в ее структурных элементах, поскольку при любом способе разрушения мицелия он полностью утрачивает способность светиться. Предложена схема активации грибного свечения (Рис. 3).

Рис. 3. Вверху: гипотетический механизм свечения гриба N. nambi (по аналогии с хемилюминесцентной реакцией люминол – Н₂О₂). Внизу: предполагаемая схема активации грибного свечения.

Факторами стимуляции грибной люминесценции являются процессы, сопровождающиеся образованием активных форм кислорода (АФК). Активировать их образование могут: а) воздействия на клеточную стенку гриба (механические, физические, химические); б) метаболические изменения в грибе, приводящие к нарушению работы ферментных систем, в частности, лигнинолитического комплекса, системы цитохрома Р-450, дыхательной цепи.