Создание теоретической и экспериментальных моделей функционирования ферментов в клетках светящихся бактерий.

Целью данного направления является создание теоретической и экспериментальных моделей функционирования ферментов в клетках светящихся бактерий. Данное исследование имеет как фундаментальный, так и очевидный прикладной аспект:

• Адекватная математическая модель люминесцентной реакции необходима для систематизации имеющихся экспериментальных данных, построения гипотез и планирования новых подходов к воспроизведению условий внутриклеточной среды.
• Максимально точное воспроизведение условий работы люминесцентной системы бактерий in vivo в условиях in vitro позволит, в перспективе, создавать эффективные биолюминесцентые тестовые системы различного назначения.

Было установлено, что при теоретическом описании организации биолюминесцентной реакции бактерий в клетке в первом приближении можно ограничиться математическим моделированием сопряженной системы из двух ферментов - NADH:FMN-оксидоредуктазы и бактериальной люциферазы. С помощью метода графов и метода диаграмм была построена модель биферментной люминесцентной реакции бактерий, которая дала хорошее приближение экспериментальных кривых (рис.1).

Рис. 1. Пример соответствия модельной кривой (зеленая линия) экспериментальным данным (красные маркеры).

Экспериментальное моделирование функционирования ферментов в клетках светящихся бактерий проводили через модификацию сред с целью повышения их вязкости и структурированности. В моделях имитировали вязкое микроокружение ферментов в матриксе путем введения растворов сахарозы или глицерина (ЭМглицерин и ЭМсахароза), а также связь с мембранными структурами путем иммобилизации в крахмальный или желатиновый гели (ЭМкрахмал и ЭМжелатин). Анализ характеристик (квантовый выход, остаточная активность ферментов, скорость распада интермедиатов, рН-оптимум, термостабильность и др.) показал, что наиболее эффективным механизмом стабилизации биферментной системы является совместная иммобилизация люциферазы и NADH:FMN-оксидоредуктазы, а также их субстратов и кофакторов в крахмальный гель. Вязкостные характеристики гелей при изменении концентрации биополимера и температуры измерили флуоресцентным методом с помощью молекулярного ротора CCVJ (рис. 2).

А	Б

Рис. 2. Микровязкость в ЭМкрахмал (А) и ЭМжелатин (Б) при разных температурах (рассчитано по флуоресценции молекулярного ротора CCVJ).

Установлено, что ЭМкрахмал обладает самой высокой вязкостью относительно других моделей, что может объяснять уникальную способность этой экспериментальной модели стабилизировать биолюминесцентную систему бактерий.