Поиск новых биолюминесцентных белков и разработка новых биолюминесцентных репортеров на их основе для практических приложений.

Фундаментальные исследования биолюминесценции позволили не только приблизиться к разгадке этой функции живой клетки, но и разработать на основе некоторых клонированных биолюминесцентных белков целый ряд принципиально новых технологий и методов для биологии, медицины и биотехнологии. Основные сферы применения биолюминесцентных белков это:

• репортерные гены и белки in vivo и in vitro;
• анализ белок-белковых взаимодействий, в том числе in vivo;
• анализ потоков кальция c помощью Ca²⁺-регулируемых фотопротеинов.

Ни один из известных на сегодняшний день биолюминесцентных белков не обладает всем спектром свойств, требуемых для идеального биолюминесцентного репортера. Дальнейшее развитие биолюминесцентных технологий требует применения лучших репортеров, которые можно получить усовершенствованием имеющихся биолюминесцентных белков методами мутагенеза и белковй инженерии, а также обнаружить в результате поиска новых биолюминесцентных белков. Широкое поле поисков обеспечивает имеющееся природное разнообразие биолюминесцентных систем, неоднократно возникших в ходе эволюции независимо в различных таксонах. В рамках данной работы использованы оба подхода к получению новых более совершенных биолюминесцентных репортеров.

I. Поиск, идентификация и сбор биолюминесцентных организмов для клонирования новых биолюминесцентных белков.

В 2012 году проведена экспедиция совместно с Австралийским Институтом морских исследований (г. Таунсвилл, Австралия) в район Большого Барьерного рифа с целью поиска, идентификации и сбора биолюминесцентных представителей зоопланктона (рис. 1).

Рис. 1. Научные сотрудники лаборатории биолюминесцентных биотехнологий СФУ проводят сбор планктона с борта исследовательского судна «Cape Ferguson» Австралийского Института морских исследований (AIMS).

В районе Большого Барьерного рифа обитает около 1300 видов зоопланктона, включая виды, аналогичные или близкородственные биолюминесцентным видам зоопланктона из других мест обитания. При этом никаких ссылок на исследование биолюминесценции зоопланктона в этом районе обнаружено не было. Предполагается, что светящиеся организмы, обитающие в теплых водах, вероятнее, чем холодноводные, будут иметь биолюминесцентные белки с температурным оптимумом активности близким к 37^oС, и потому пригодными для использования в качестве репортеров в клетках млекопитающих.

Список идентифицированных и охарактеризованных в отношении типа биолюминесцентной системы светящихся организмов включает следующие таксоны: Copepoda, Amphipoda, Ostracoda, Hydromedusae, Anthomedusae, Siphonophora, Salpa, Ctenophora. Для всех из них были отобраны и законсервированы образцы для дальнейших исследований в условиях стационарной лаборатории.

Рис. 2. Исследования образцов зоопланктона в лаборатории судна «Cape Ferguson». Образцы биолюминесцентного зоопланктона класса Salpidae и отряда Siphonophorae при увеличении.

1. Осуществлен поиск, идентификация, сбор и консервирование для последующих работ ряда новых биолюминесцентных организмов из биолюминесцентного зоопланктона Большого Барьерного рифа. Отбирали организмы с целентеразин- и люциферин Vargula-зависимыми типами биолюминесцентных систем как наиболее перспективные с точки зрения клонирования новых биолюминесцентных белков.
2. Впервые установлен тип и субстратная специфичность биолюминесцентной системы сальп как люциферазная целентеразин-зависимая система при исследовании особей Salpa sp., представителя класса Salpidae.
3. Сконструирована представительная экспрессионная кДНК-библиотека генов из биолюминесцентного представителя Siphonophorae, выявляющий целентеразин-зависимый люциферазный тип биолюминесцентного сигнала. Проведен функциональный поиск биолюминесцентных генов в бактериальной системе экспрессии. Для дальнейшего поиска биолюминесцентных генов в кДНК-библиотеках Siphonophora sp. предполагается использовать эукариотическую систему экспрессии.

Для дальнейшей работы по поиску новых биолюминесцентных генов будут использованы законсервированные образцы биолюминесцентных организмов. В случае клонирования новых биолюминесцентных генов из кДНК-библиотек, видовая принадлежность конкретного образца будет устанавливаться по генам рибосомальных РНК по имеющимся базам данных.

II. Разработка новых биолюминесцентных репортеров для различных практических применений.

Стандартным подходом к получению белка с улучшенными свойствами является мутагенез, случайный и/или направленный. Залогом успеха данного подхода является быстрый и простой метод отбора вариантов с требуемыми свойствами среди большого количества сконструированных мутантов. И оптимальным вариантом здесь является фукциональный отбор мутантов непосредственно на уровне колоний из рассева представительных библиотек мутантов, что позволяет проводить направленную эволюцию целевого белка путем нескольких последовательных раундов мутагенеза и при сочетании направленных и случайных изменений. Для разработки усовершенствованного секретируемого биолюминесцентного репортера на основе люциферазы из Metridia longa, была получена экспрессионная конструкция pET22b-YebF1-ML164, позволяющая вести скрининг мутантов люциферазы непосредственно по свечению колоний (рис.3) и разработана методика отбора получаемых мутантов. Это стало возможным при использовании для регистрации свечения колоний высокочувствительной имиджинговой системы BFI System (Bioluminescence & Fluorescence Imaging System, рис. 3), разработанной в ИПФ РАН (Нижний Новгород), предназначенной для визуализации биолюминесценции и флуоресценции живых биологических объектов (молекулярного in vivo имиджинга).

Молекулярный имиджинг in vivo является одним из перспективных применений биолюминесцентных белков благодаря их уникальным репортерным свойствам, среди которых высокая чувствительность, широкий линейный диапазон, нетоксичность для живого, отсутствие фона, возможность исследования динамики in vivо. Но основным недостатком имеющихся биолюминесцентных репортеров на сегодняшний день является их «голубой» спектр излучения, большая часть которого не попадает в «окно прозрачности» биологических объектов и поглощается окружающими тканями. Поэтому одно из направлений совершенствования биолюминесцентных репортеров – получения мутантных белков со сдвигом спектра в красную область, либо использование для сдвига спектра в красную область фьюжинов с подходящими красными флуоресцентными белками. Такие биолюминесцентные репортеры позволяют визуализировать молекулярные клеточные процессы прямо в мелких лабораторных животных in vivo. На рисунке 4 показан мониторинг развития опухоли аденокарциномы ободочной кишки, меченой мутантной «желтой» люциферазой Renilla muelleri, при подкожном расположении у мыши.

1. Получена экспрессионная конструкция на основе секреторного белка YebF из E. coli и разработан метод функционального отбора мутантов, позволяющие вести отбор мутантных вариантов разрабатываемого биолюминесцентного репортера с заданными свойствами на уровне колоний по их свечению. Регистрация свечения осуществляется при использовании высокочувствительной имиджинговой системы BFI System (Bioluminescence & Fluorescence Imaging System), разработанной в ИПФ РАН (Нижний Новгород).
2. Разработаны методика визуализации опухолей, меченых биолюминесцентными целентеразин-зависимыми репортерами, в мелких лабораторных животных при подкожном расположении при использовании имиджинговой системы BFI System (Bioluminescence & Fluorescence Imaging System), разработанной в ИПФ РАН (Нижний Новгород).