Выяснение механизма функционирования целентеразин-зависимых биолюминесцентных белков различных морских светящихся организмов. Создание вариантов рекомбинантных белков с измененными характеристиками биолюминесценции и разработка новых методов молекулярного анализа на их основе. |
При разработке лабораторного теста для диагностирования рассеянного склероза в тесном сотрудничестве с лабораторией химии РНК (ФГБУН ИХБЭМ, Новосибирск) получен биолюминесцентный сенсор нового типа – химический коньюгат 2‘-F-РНК-аптамера, специфичного к патологическим аутоантителам против основного белка миелина и Са2+-регулируемого фотопротеина обелина. Микропланшетный анализ модельных образцов показал перспективность полученного соединения как высокочувствительного сенсора для выявления антител, ассоциированных с развитием РС.
Биолюминесцентная ферментативная система, выделенная из морских бактерий, использована для определения антиоксидантной активности фуллеренола – водорастворимого производного фуллеренов и перспективного фармацевтического агента. Выявлены концентрации фуллеренола, уменьшающие и увеличивающие эффекты токсикантов окислительной природы, а также количественно оценена актиоксидантная активность фуллеренола при различных его концентрациях. Разработана и изготовлена полезная модель портативного биолюминометра «LumiShot». |
На основе вариантов Са2+-регулируемого фотопротеина обелина с измененными характеристиками биолюминесценции разработан способ одновременного микроанализа двух мишеней в одном образце. Два варианта Са2+-регулируемого фотопротеина обелина, полученные сайт-направленным мутагенезом аминокислот активного центра – H22E; W92F и Y139F, обладают соответственно быстрым фиолетовым сигналом (kd=6.1 s-1, λmax=387 нм) и медленным зеленым сигналом (kd=0.6 s-1, λmax=498 нм). Эффективное разделение сигналов соответствующих репортеров реализуется с помощью широкополосных оптических фильтров и во времени (рисунок). На основе данных вариантов обелина разработан и опробирован на клинических образцах способ одновременного определения двух мишеней на примерах: а) циркулирующих форм пролактина (тотального и иммуноглобулин-связанного); б) гонадотропных гормонов (ЛГ - лютеинизирующего и ФСГ - фолликулостимулирующего); в) выявление двух аллелей гена при примере генотипирования однонуклеотидного полиморфизма гена F5 человека – коагуляционного фактора V Leiden (лейденская мутация) 1691 G→A (R506Q). Анализ проводится в высокопроизводительном микропланшетном формате. Полученные результаты биолюминесцентного определения близки к таковым, определенным стандартными методами: по содержанию тотального пролактина (R2 = 0.92 от РИА; N=83), по содержанию ЛГ (R2 = 0.92 от РИА; N=71), ФСГ (R2 = 0.94 от РИА; N=71), 100% совпадение выявлений SNP по фактору Лейден (N=69, от анализа ПЦР в реальном времени). Подход не имеет аналогов и позволяет существенным образом ускорить анализ, сократить материальные затраты, а также избежать ошибок традиционного раздельного определения.
Опубликовано в... A.N. Kudryavtsev, V.V. Krasitskaya, A.I. Petunin, A.Y. Burakov, L.A. Frank. Simultaneous bioluminescent immunoassay of serum total and IgG-bound prolactins . Anal. Chem. 2012, 84, 3119−3124 V.V. Krasitskaya, A.N. Kudryavtsev, O. Shimomura, L.A. Frank. Obelin mutants as reporters in bioluminescent dual-analyte binding assay. Anal. Methods. 2013, 5, 636-640 |
